Persönliches
Verschiedenes
Techniken
Präparationen
Natur
Abschliessendes
Präparation von Lipidvesikeln
Präparation von Lipidvesikeln
Lipide sind aufgrund ihrer interessanten und einmaligen Architektur Ausgangspunkt verschiedenster Forschungsarbeiten. Phospholipidmoleküle enthalten eine geladene Kopfgruppe und einen größeren, hydrophoben Schwanz. Diese Schwanzgruppen stehen sich nach erfolgreichen Präparationen entgegen. Lipid-Doppelschichten sind für den Wissenschaftler interessant, da sie ein gutes Modell für semipermeable Zellmembranen sind. Ferner lassen sich mit an Grenzflächen abgeschiedenen Doppelschichten eine Vielzahl von Lipid – Molekül –Interaktionen studieren. Lipid-Vesikel sind auf Grund der Ähnlichkeit mit Zellmembran gut geeignet, Medikamente in den Körper an der richtigen Stelle zu schleußen und die Bioverfügbarkeit von Medikamenten zu steigern. Grundlage für diese Arbeiten ist die Präparation von Lipidvesikeln, die auch als Liposomen bezeichnet werden. Abbildung 1 zeigt ein solches Liposomen.
Abb. 1: Aufbau von Lipid - Liposomen
Im Folgenden sollen die einzelnen Präparationsschritte für die Bildung von Liposomen ausführlich beschrieben werden.
| ♦ |
|
|
|
|
| ♦ |
|
|
|
|
| ♦ |
|
|
|
|
| ♦ | Der getrocknete Lipidfilm wird in Wasser aufgenommen, so dass sich erneut eine Konzentration von 5 mg/ml bildet. |
|
|
|
| ♦ |
|
|
|
|
| ♦ | Die Lösung wird so lange in einem Ultraschallbad beschallt, bis die Farbe von milchig-trüb nach transparent umschlägt. Dabei sollte ein leichter, blauer Schimmer aus gestreutem Licht zu sehen sein. |
|
|
|
| ♦ |
|
|
|
|
| ♦ | Abschließend wird die fertige Vesikellösung auf die gewünschte Konzentration verdünnt: Je nach Analysetechnik sind unterschiedliche Konzentartion erwünscht. |
|
|
|
| ♦ |
|
|
|
|
| ♦ | Die fertige Lipidlösung wird oberhalb ihrer Phasenübergangstemperatur gelagert, um ein Fusionieren zurück zu multilamellaren Vesikeln zu verhindern. |
-
Ein oft diskutierter Schritt bei der Herstellung von Lipid-Vesikeln ist der Einsatz eines Extruders. Ein Extruder, wie er in Abbildung 2 zu sehen ist, ist ein Werkzeug, bei dem eine Polycarbonat-Membran mit definierter Größe zwischen zwei Fliesscheiben gepresst wird. Der Flies, ähnlich einem Filterpapier, dient dazu, die Lösung auf die gesamte Fläche der Membran zu verteilen. Meist werden zwei Spritzen verwendet, um die Lösung zu händeln. In der einen befindet sich die Ausgangslösung und in der anderen die extrudierte Lösung. Man sollte bei dem Einsatz eines Extruders bis zu 10, mache empfehlen sogar 20 Extrusionsschritte durchführen, um eine monodisperse Lösung zu erhalten.
Abb. 2: Labor- oder Handextruder der Firma Avanti
Der Einsatz des Extruders erfordert zusätzlichen Aufwand. Als Vorteil hat man anschließend eine garantierte Vesikelgröße. Den Extruder können zunächst nur Vesikel, die kleiner als die Porengröße der Membran sind, die Membran passieren. Größere Vesikel werden an den Poren geschert, reißen auf und organisieren sich neu. Um den Nutzen eines Extruders gegenüber der reinen Beschallung zu prüfen, wurde die Größe beschallter und extrudierter Vesikel mittels Dynamischer Lichtstreuung (DLS) gemessen. Zur Bestimmung der Diffusionskoeffizienten D wurde die Relaxationsrate Γ gegen q² aufgetragen und Linearität geprüft. Die Diffusionsgeschwindigkeit kann aus den Anstieg der Geraden entnommen werden. Abbildung 3 zeigt das Ergebnis für die beschallten Vesikel bei unterschiedlicher Beschallungsdauer, Abbildung 4 für zusätzlich nach 15 minütiger Beschallungsdauer extrudierte Vesikel.
Abb. 3: Relaxationsrate Γ gegen q² - Auftragung für beschallte DMPC-Vesikel. Die Punkte stellen Messwerte und die Geraden lineare Fits dar. Die Legende gibt die jeweiligen Beschallungszeiten an.
Abb. 4: Relaxationsrate Γ gegen q² - Auftragung für extrudierte DMPC-Vesikel. Die Punkte stellen Messwerte und die Geraden lineare Fits dar.
Abbildung 3 und 4 zeigen deutlich, dass ein linearer Zusammenhang zwischen der Relaxationsrate G und dem Quadrat des Streuvektor, q², besteht. Somit ist es möglich, aus dem Anstieg die Diffusionsgeschwindigkeit der DMPC-Vesikel zu bestimmen und diese Werte in die Stokes-Einstein-Beziehung einzusetzen, um die Vesikelgröße zu erhalten. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Zur Erinnerung hier die Stokes-Einstein-Beziehung:
wobei kb die Boltzmannkonstante, η die dynamische Viskosität und rh der hydrodynamische Teilchenradius ist.
Tab. 1: Ergebnisse der DLS-Messungen
|
Bei den beschallten Vesikeln gibt es einen eindeutigen Trend zu geringeren Teilchendurchmessern mit steigender Beschallungszeit. Bei 90 minütiger Beschallungszeit ergibt sich mit 40 nm ein schon sehr kleiner Durchmesser. Die Größe der extrudierten Vesikel hängt überraschenderweise nur geringfügig von der Wahl des Filters ab (siehe Abbildung 4). Die Vesikel des 50 nm Filters sind deutlich größer und die des 100 nm Filters deutlich geringer als die vom Hersteller angegebene Filtergröße. Somit spielt die Wahl der Porengröße bei der Vesikelherstellung keine wesentliche Rolle. Als Ursache dafür kann vermutet werden, das die vom Hersteller angegebenen Porengrößen von den tatsächlichen abweichen oder sich die Vesikel nach Passieren des Filters neu organisieren.
Neben der Größe der Vesikel ist auch die Größenverteilung ein wichtiger Parameter. Eine weitestgehend monodisperse Vesikelprobe sollte es einfacher haben, sich gleichmäßig über die gesamte Oberfläche zu verteilen und einen geschlossenen Lipidfilm zu bilden. Einen Anhaltspunkt für die Größenverteilung bietet die Peakbreite der Relaxationsratenverteilung. Da zwischen der Relaxationsrate und q² ein klar linearer Zusammenhang für die Proben nachgewiesen werden konnte, ist es möglich, repräsentativ die Relaxationsratenverteilung bei einem q-Wert zu betrachten. Abbildung 5 und 6 zeigen die Ergebnisse für die beschallten Vesikel für einen Detektorwinkel von 90°.
Abb. 5: Relaxionsratenverteilung bei 90° für 15 und 60 minütige Beschallungszeit
Abbildung 5 zeigt deutlich, dass die Relaxionsratenverteilung mit steigender Beschallungszeit abnimmt. Sie erstreckt sich für die 15 minütige Beschallungszeit von 10² bis 104 s-1, für eine 60 minütige Beschallungszeit nur noch von 10³ bis 104 s-1. Somit nimmt neben der Teilchengröße auch die Polydispersität mit steigender Beschallungszeit ab. Abbildung 6 zeigt die Relaxionsratenverteilungen für extrudierte Vesikel.
Abb. 6: Relaxionsratenverteilung bei 90° für extrudierte Vesikel
Abbildung 6 zeigt, dass bei beiden Filtergrößen die Relaxionsratenverteilung eng ist und die Proben wenig polydispers sind. Die Peakbreite des 50 nm Filter ist vergleichbar mit der 60 minütigen Beschallungszeit, für den 100 nm Filter ist die 60 Minuten beschallte Probe sogar etwas besser. Ein Argument für die Extrudermethode ist jedoch, dass sie wesentlich reproduzierbarer ist.
Abschliessend möchte ich noch erwähnen, dass die DLS-Messungen und Auswertungen in Zusammenarbeit mit Prof. Thomas Hellweg (Universität Bielefeld) und Prof. Matthias Karg (Universität Beyreuth) seinerzeit an der TU Berlin durchgeführt wurden. An dieser Stelle möchte ich mich noch einmal für die gute Zusammenarbeit bedanken.
Der Artikel kann hier in Form eines pdf-Dokumentes herruntergeladen werden. 